О состоянии мембран тромбоцитов у больных инсулинзависимым сахарным диабетом при диабетическом кетоацидозе

Диабетический кетоацидоз (ДКА) является острым осложнением инсулинзависимого сахарного диабета (ИЗСД). Летальность от диабетической комы по-прежнему остается высокой — от 1 до 40% [1, 10]. В США ДКА встречается у 14% всех госпитализированных больных диабетом, и эта величина остается постоянной в течение последних 20 лет [11, 12].

Тяжесть состояния при ДКА обусловлена резкой дегидратацией организма, декомпенсированным метаболическим ацидозом, выраженным дефицитом электролитов (калия, натрия, фосфора, магния и др.), гипоксией, гиперосмолярностью и нередко сопутствующим интеркуррентным заболеванием [1, 6]. Обучение больных, страдающих сахарным диабетом (СД), принципам самоконтроля и тактике поведения при неотложных состояниях позволило значительно снизить риск возникновения кетоацидоза (до 0,5—2% в год) [5]. Для ДКА характерны глубокие нарушения тромбоцитарно-коагуляционного гемостаза [9]. В связи с выявлением в последние годы роли процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [2], наличием связи между интенсивностью ПОЛ и уровнем тромбинообразования представляет несомненный интерес исследование состояния мембран тромбоцитов у больных ИЗСД.

Материалы и методы

Обследовано 120 больных ИЗСД (55 мужчин и 65 женщин) в возрасте от 18 до 55 лет, из них 90 пациентов с ДКА и 30 больных ИЗСД без осложнений. Продолжительность заболевания составила от 1 года до 20 лет, средняя потребность в инсулине — 45 ± 0,9 ЕД в сутки. Контролем служили 30 практически здоровых лиц. Среди обследованных больных ИЗСД 38 пациентов были в состоянии умеренного кетоацидоза, 47 больных — в стадии декомпенсированного кетоацидоза, или пре- комы, и 5 человек — в состоянии кетоацидотиче- ской комы. Диагноз ИЗСД верифицировали с помощью определения уровня С-пептида.

Для выделения клинических стадий ДКА использовали классификацию М. И. Балаболкина [1].

Всем больным проведены полное клиническое и биохимическое обследование, контроль кислотно-щелочного состояния, в качестве критерия компенсации углеводного обмена использовали определение уровня гликированного гемоглобина при помощи анализатора 1040 ("Boehringer Mannheim").

Для биохимических исследований использовали тромбоциты. Определение содержания основных фракций фосфолипидов (лизофосфатидилхо- линов — ЛФХ, фосфатидилсеринов — ФС, сфингомиелинов — СМ, фосфатидилхолинов — ФХ, фосфатидилэтаноламинов — ФЭА и холестерина — ХС) клеточных мембран проводили методом тонкослойной хроматографии с использованием пластинок силуфол (Чехия). Содержание продуктов ПОЛ в клеточных мембранах определяли следующими методами: первичных — диеновых конъюгатов (ДК) — по И. Д. Стальной (1977 г.), конечных — шиффовых оснований (ШО) — по Ф. 3. Меерсону и соавт. (1979 г.).

Исследование активности ферментов антира- дикальной защиты в клеточных мембранах тромбоцитов проводили следующими методами: супероксидцисмутазы (СОД) — по В. С. Чумакову и Л. Ф. Осинской (1979 г.), каталазы — по Е. С. Асатиани (1969 г.). Исследование активности ферментов трансмембранного переноса ионов Na⁺-, К⁺-, Mg²⁺- и Са²⁺-АТФаз клеточных мембран проводили, как описано в ряде работ (А. М. Казенов и соавт., 1984 г.; Reinila и соавт., 1982 г.).

Полученные результаты подвергли математической обработке методом вариационной статистики с помощью пакета прикладных программ по статистической обработке информации (SPSS), а также пакета анализа Microsoft Excel на ЭВМ IBM PC (486 DX4). Достоверность выявляемых различий определяли по методу Фишера—Стьюдента, анализируя среднюю величину вариационного ряда (Л/), среднее квадратичное отклонение вариационного ряда (о), среднюю ошибку среднего квадратичного отклонения (т). Результаты исследований обработаны также методом парного корреляционного анализа с использованием пакета программ "Статистика в медико-биологических исследованиях" и методами однофакторного дисперсионного и пошагового регрессионного анализов с использованием пакета программ.

Результаты и их обсуждение

Установлено достоверное увеличение в клеточных мембранах тромбоцитов содержания наиболее токсичных продуктов пероксидации — ДК, причем их уровень увеличивался по мере нарастания тяжести кетоацидоза (табл. 1). Наряду с этим уровень конечных продуктов свободнорадикального окисления - ШО - повышался у больных с умеренно выраженным кетоацидозом до 14,34 ± 0,64 усл. ед. фл. по сравнению с показателями больных ИЗСД без осложнений — 12,10 ± 0,43 усл. ед. фл. (р < 0,01). В стадии декомпенсированного ДКА отмечалась тенденция к снижению образования ШО (/? < 0,05).

Таблица 1

Содержание продуктов ПОЛ, активность антиоксидантных ферментов, активность ферментов трансмембранного транспорта ионов у больных ИЗСД в состоянии ДКА (М ± т)

Примечание. Здесь и в табл. 2: звездочки — достоверность (р < 0,05) различий: одна — у больных ИЗСД без осложнений с показателями здоровых; две — у больных ИЗСД с кетоацидозом с показателями у больных ИЗСД без осложнений; три — у больных ИЗСД с умеренным ДКА с показателями у больных ИЗСД с декомпенсированным ДКА.

Полученные результаты, возможно, свидетельствуют о снижении резистентности мембран к окислительному стрессу, так как шиффообразова- ние рядом авторов [8] рассматривается как защитный механизм, способствующий детоксикации первичных продуктов ПОЛ, оказывающих наибольшее повреждающее воздействие на мембрану. Нами выявлено также прогрессирующее снижение образования конечных продуктов ПОЛ при нарастании продолжительности заболевания и наличии сосудистых осложнений.

В последних работах установлено, что активация процессов ПОЛ у больных ИЗСД сопровождается нарушением активности антиоксидантных ферментов, причем отмечена неоднозначность этих изменений [5, 7]. В наших исследованиях у больных ИЗСД без осложнений выявлено повышение активности СОД (3,99 ±0,11 усл. ед. торможения/мг белка) и каталазы (0,99 + 0,036 мкмоль/мин/мг белка) по сравнению с показателями здоровых — 2,56 ± 0,18 усл. ед. торможения/мг белка и 0,85 ±0,11 мкмоль/мин/мг белка соответственно (р < 0,05). При нарастании выраженности ДКА (в стадию умеренно выраженного кетоацидоза) установлено достоверное снижение активности СОД и каталазы по сравнению с показателями больных ИЗСД с неосложненным течением (р < 0,001). В стадии декомпенсированного ДКА обнаружено резкое (в 3 раза) снижение активности каталазы по сравнению с показателями больных ИЗСД с неосложненным течением (р < 0,001). У больных ИЗСД в состоянии диабетической комы показатели СОД и каталазы имели минимальные значения:

• ± 0,16 усл. ед. торможения/мг белка и 0,301 ± 0,04 мкмоль/мин/мг белка соответственно.

Необходимо отметить выявленную обратную корреляционную зависимость между уровнем активности СОД и содержанием ДК в клеточных мембранах тромбоцитов у больных ИЗСД в состоянии ДКА (г= —0,8; р < 0,01), что свидетельствует о дисбалансе в системе ПОЛ—антиоксидантная система. В то же время установлено наличие обратной корреляционной зависимости активности каталазы от продолжительности заболевания обсуждаемой группы больных ИЗСД (г =—0,7; /7 < 0,01).

Дисбаланс в системе ПОЛ—антиоксидантная система в мембранах тромбоцитов у больных ИЗСД в состоянии ДКА изменяет функциональные параметры клеточных мембран, в частности транспортных АТФаз (см. табл. 1). Достоверно снижается активность Na⁺-, К⁺-АТФазы по мере нарастания тяжести ДКА (р < 0,001). 1\^²⁺-АТФаза имеет тенденцию к увеличению активности в стадию умеренного ДКА до 0,138 ± 0,016 мкмоль/ч/мг белка по сравнению со 127 ± 0,01 мкмоль/ч/мг белка у больных с неосложненным ИЗСД. В стадию декомпенсированного ДКА активность 1У^²⁺-АТФазы снижается, и наименьшая активность Мв²⁺-АТФазы установлена в стадию диабетической комы — 0,125 ± 0,04 мкмоль/ч/мг белка. Установлено, что активность Са²⁺-АТФазы у больных ИЗСД без осложнений повышается до 0,336 ± 0,06 мкмоль/ч/мг белка по сравнению с показателями здоровых (0,324 ± 0,027 мкмоль/ч/мг белка), возможно, компенсаторно. В стадию умеренно выраженного ДКА сохраняется тенденция к повышению активности Са²⁺-АТФазы, по мере нарастания тяжести ДКА установлено достоверное снижение показателей обсуждаемой АТФазы. У больных ИЗСД в состоянии диабетической комы уровень активности Са²⁺-АТФазы составил 0,217 ± 0,12 мкмоль/ч/мг белка.

Следующим этапом нашего исследования было изучение особенностей липидного состава мембран тромбоцитов у больных ИЗСД в состоянии ДКА. Мы получили достоверное снижение наиболее ненасыщенных фракций фосфолипидов — ФЭА и ФХ больных ИЗСД в состоянии ДКА, причем уменьшение этих фракций нарастало по мере усугубления тяжести ДКА при одновременном увеличении в клеточных мембранах фракции ЛФХ. Наибольшее содержание ЛФХ установлено в стадию декомпенсированного ДКА (0,021 ± ± 0,003 ммоль/мл) и диабетической комы (0,023 ± 0,004 ммоль/мл). Полученные изменения в составе фосфолипидов сопровождались увеличением содержания ХС в составе мембран тромбоцитов и увеличением коэффициента соотношения ХС/фосфолипиды. Активное накопление ХС в мембранах тромбоцитов у больных ИЗСД в состоянии ДКА имеет особое значение. Известно, что избыточное накопление ХС способствует существенным мембранным сдвигам, так как при этом нарушается одна из интегральных характеристик — соотношение ХС/фосфолипиды [3, 8], что в свою очередь приводит к увеличению ’’жесткости” мембраны, изменению активности ключевых ферментов трансмембранного переноса ионов, в частности ионов Са²⁺, являющегося вторичным посредником в активации тромбоцитов [4] (табл. 2).

Тесная связь между продуктами ПОЛ, активностью ферментов трансмембранного переноса ионов и фосфолипидным составом клеточных мембран тромбоцитов у больных ИЗСД в состоянии ДКА выражается в виде отрицательной корреляции между Na²⁺-, К⁺-АТФазой и уровнем ДК (г = —0,76; р < 0,05). Наряду с этим у больных ИЗСД в состоянии ДКА установлена отрицательная корреляционная связь между активностью СОД и Mg²⁺-AT®a3oft (г = -0,49; р < 0,05), между активностью СОД и Са²⁺-АТФазой (г = —0,76; р < 0,05). Эта связь — между активностью фермента антирадикальной защиты и уровнем ферментов трансмембранного транспорта ионов — обнаружена только у больных ИЗСД в состоянии кетоацидоза. Не исключено, что это обусловлено компенсаторным повышением активности обсуждаемых АТФаз у больных ИЗСД в состоянии метаболического стресса. Одновременно у больных ИЗСД в состоянии ДКА установлена достоверная корреляционная связь между фосфолипидами клеточных мембран тромбоцитов и активностью ферментов антиоксидантной защиты. Это прояв-

Таблица 2

Содержание основных фракций фосфолипидов и ХС (в ммоль/л) в клеточных мембранах тромбоцитов у больных ИЗСД в состоянии кетоацидоза (М ± т)

ляется в виде связи между уровнем ФЭА и активностью СОД (г = 0,68; р < 0,001), между содержанием в клеточных мембранах ФЭА и активностью каталазы (г = 0,65; р < 0,05). Кроме того, у больных ИЗСД в состоянии ДКА установлена достоверная корреляционная связь между основными фосфолипидами клеточных мембран и содержанием ХС, а именно между ФХ и ФЭА (г = 0,56; р < 0,05), отрицательные корреляционные связи между содержанием ХС и ФЭА (г=-0,71; р< 0,05).

Выявленные корреляции у больных ИЗСД в состоянии кетоацидоза — еще одно свидетельство взаимосвязи и взаимообусловленности мембрано- дестабилилизирующих процессов у больных ИЗСД.

Таким образом, особенностью мембранодестабилизирующих процессов, характерных только для больных ИЗСД в состоянии кетоацидоза, являются весьма высокий уровень ДК, очень низкая активность каталазы и СОД при одновременном повышении активности ферментов трансмембранного переноса ионов — Mg²⁺- и Са²⁺-АТФаз. В клеточных мембранах тромбоцитов у больных ИЗСД в состоянии кетоацидоза происходят наиболее глубокие нарушения фосфолипидного состава с избыточным накоплением ХС и увеличением соотношения ХС/фосфолипиды, что, несомненно, оказывает неблагоприятное воздействие на структурно-функциональную организацию обсуждаемой популяции клеток крови.

Для объективной оценки характера взаимосвязи структурно-функциональных нарушений мембран тромбоцитов с клинической картиной мы использовали метод пошагового регрессионного анализа. Зависимыми переменными служили показатели структурно-функционального состояния мембран тромбоцитов больных ИЗСД. В качестве независимых переменных, характеризующих клиническую картину, в модель пошагового регрессионного анализа были включены следующие переменные: уровень НЬ А_1с, изменения сосудов глазного дна, отягощенность наследственного анамнеза по СД, выраженность ацетонурии, длительность СД.

У больных ИЗСД в состоянии кетоацидоза выявлена достоверная взаимосвязь показателей структурно-функциональной организации мембран тромбоцитов с клинической картиной заболевания. Установлено, что активность Na²⁺-, К⁺-АТФазы коррелирует с уровнем ацетонурии и изменениями на глазном дне, причем связь между активностью Na⁺, К⁺-АТФазы и изменениями на глазном дне носит отрицательный характер. Изменения на глазном дне и уровень ацетонурии обусловливают 19% отклонений активности Na⁺, К⁺-АТФазы в мембранах тромбоцитов.

Уровень активности СОД у больных ИЗСД в состоянии умеренного кетоацидоза статистически достоверно взаимосвязан с длительностью СД. Длительность СД обусловливает 22% отклонений активности СОД у обсуждаемой группы больных ИЗСД. Уровень Hb A_t и длительность СД оказывают статистически достоверное влияние на содержание ФС и поясняют 27% отклонений содержания этих фосфолипидов в клеточных мембранах тромбоцитов у больных ИЗСД в состоянии кетоацидоза, причем взаимосвязь содержания ФС с длительностью СД носит отрицательный характер. Установлено, что уровень ФЭА также статистически достоверно взаимосвязан с длительностью СД (отрицательная взаимосвязь) и уровнем компенсации СД (НЬ А_1с). Уровень НЬ А_1с и длительность ИЗСД обусловливают 32% отклонений обсуждаемого типа фосфолипидов в клеточных мембранах больных ИЗСД в состоянии кетоацидоза.

Таким образом, пошаговый регрессионный анализ показателей структурно-функционального состояния клеточных мембран тромбоцитов с клиническими проявлениями ИЗСД в состоянии ДКА позволяет предполагать, что мембранопатологические изменения в клеточных мембранах в известной степени обусловлены клиническими проявлениями, в частности для больных ИЗСД в состоянии кетоацидоза показатели ПОЛ, активность ферментов антирадикальной защиты, фосфолипидный состав клеточных мембран во многом зависят от таких клинических проявлений, как декомпенсация диабета, наличие сосудистых осложнений и длительность диабета.

Выводы

1. ДКА — острое осложнение СД, способствующее активации ПОЛ, нарушению фосфолипидного состава мембран тромбоцитов и снижению антирадикальной защиты.
2. Выраженность дестабилизации клеточных мембран тромбоцитов у больных ИЗСД в состоянии ДКА зависит от степени тяжести кетоацидоза, длительности заболевания, наличия сосудистых осложнений.