Состояние NPY-синтезирующих клеток островков Лангерганса у нормальных и диабетических крыс при введении синтетического нейропептида Y

Известно, что нейропептид Y (NPY), широко представленный в ядрах гипоталамуса [9], играет важную роль в центральной регуляции метаболи ческих процессов в норме и при патологии, в ча стности при сахарном диабете [13]. Наши преды дущие исследования показали важную роль NPY в регуляции функции р-клеток в норме и при экспе риментальном диабете, что проявлялось торможе нием деструкции р-клеток, стимуляцией синтеза и секреции инсулина [4]. В последние годы была ус тановлена способность эндокринных клеток ост ровков Лангерганса эмбрионов [20, 24] и половоз релых особей синтезировать NPY [8, 18, 21, 22]. В связи с этим было выдвинуто предположение о его важной роли в паракринной регуляции синтеза и секреции инсулина [8, 21, 30], которое получило дальнейшее подтверждение при идентификации Y1 -рецепторов NPY на мембране р-клеток [19]. Вместе с тем до сих пор состояние NPY-синтези рующих клеток островков Лангерганса у животных с диабетом практически не изучалось, а вопрос о возможности синтеза самого пептида в островках половозрелых здоровых особей является предме том исследования [18, 23]. В связи с этим целью на шей работы являлось изучение состояния NPY- синтезирующих клеток в островках Лангерганса у нормальных и диабетических крыс и при хрониче ском введении синтетического NPY животным с диабетом. Материалы и методы Исследование проведено на 70 крысах линии Вистар в возрасте 4-6 мес массой 250-270 г. Экс периментальные животные были разделены на 4 группы: 1-я - контрольные крысы; 2-я - крысы с диабетом длительностью 3-5 нед; 3-я и 4-я - кры сы с диабетом длительностью 5 нед, которым с 26-го дня вводили NPY интраперитонеально или интрацеребровентрикулярно. Использовали стреп- тозотоциновую модель сахарного диабета [4, 28]. Синтетический NPY ("Peninsula Laboratories Inc.", США) вводили с 26-го по 35-й день течения диа бета: интрацеребровентрикулярно в дозе 10 нг и интраперитонеально в дозе 2,5 мкг по ранее опи санной методике [4]. На протяжении всего экспе римента у животных систематически контролиро вали уровень гликемии. Через 24 ч после послед него введения пептида на фоне 16-часового голо дания животных декапитировали, извлекали под желудочную железу и подвергали ее гистологиче ской обработке. Идентификацию инсулин- и NPY- иммунореактивных клеток в срезах поджелудочной железы толщиной 5 мкм проводили методом не прямой иммунофлюоресценции с использованием наборов фирмы "Peninsula Laboratories Inc." (США). Для оценки состояния клеток использова ли компьютерную систему цифрового анализа изо бражения VIDAS-386 [4]. На срезах, обработанных антисывороткой к NPY, в автоматическом режиме по специальной программе VIDAS-2.5 ("Kontron Elektronik", Германия) определяли количество пеп- тидсинтезирующих клеток в плоскости среза, при дальнейшем изложении именуемое как количество клеток в островке, их площадь (в мкм2), а также площадь (в мкм2), концентрацию и содержание в клетках иммунореактивного материала (в условных микроединицах - мкЕ). Эти же параметры опре деляли при изучении срезов, обработанных анти сывороткой к инсулину. Определение концентра ции инсулина в крови проводили по общеприня тым ранее описанным методикам [4]. Результаты исследования обрабатывали статистически при по мощи программы Ехсе1-7 с использованием Г-кри- терия Стьюдента. Результаты и их обсуждение У нормальных животных в островках в среднем идентифицировалось 7 NPY-иммунореактивных клеток, которые имели разнообразную форму и размеры (рис. 1). В большинстве островков клетки локализованы в периферической зоне по всему пе риметру. Наиболее часто встречались округлые, полигональные, а также нейроноподобные клетки. По-видимому, последние представляют собой ис тинные нейроны (рис. 2), наличие которых в ост ровках Лангерганса является установленным фак том [2], а последние работы [27] о выявлении в них NPY подтверждают наше предположение. Таким образом, наши данные подтверждают мнение [8, 18] о том, что синтез NPY в островках возможен не только у эмбрионов [20, 24], но и у интактных половозрелых грызунов. Предполагается, что источ ником синтеза NPY в островках могут также быть 0-, а-, А- и панкреатические полипептидсинтези- рующие клетки [18, 22, 31]. С помощью алгоритма классификации Bayes classifier из программного пакета VIDAS-2.5 ("Kon tron Elektronik", Германия) нами было установлено, что NPY-иммунореактивные клетки островков представляли собой 2 отдельных класса, достовер но различающихся по всем регистрируемым пара метрам. Клетки 1-го класса отличались более низ кой концентрацией и содержанием иммунореак тивного материала, а также относительно большей площадью клеток и площадью в них иммунореак тивного материала. Соотношение клеток 1-го и 2-го класса составляло 43 и 57% соответственно. Выявленные нами различия параметров NPY-им- мунореактивньгх клеток с учетом данных литерату ры [11], по-видимому, отражают различные фазы секреторного цикла эндокринных клеток: постсек реторную для клеток 1-го класса и фазу активного синтеза и накопления пептида для 2-го класса. Развитие сахарного диабета к концу 3-й недели приводило к уменьшению количества 0-клеток в островках более чем в 2 раза. При этом отмечали увеличение площади клеток и площади в них им мунореактивного материала. Концентрация инсу лина в клетках уменьшалась, а его содержание дос товерно увеличивалось по отношению к контролю (см. таблицу). Эти изменения сопровождались уве личением уровня гликемии до 8,69 ± 0,44 ммоль/л (в контроле 3,71 ± 0,15 ммоль/л) и свидетельство вали о деструкции 0-клеток и компенсаторном уси лении синтеза и секреции инсулина сохранивши мися клетками. В этот же период среднее количество идентифи цированных NPY-иммунореактивных клеток в ост ровках увеличивалось по сравнению с контролем более чем в 2 раза (см. таблицу), встречались даже отдельные островки, содержащие более 30 имму нореактивных клеток (рис. 3). Отмечалось досто верное увеличение площади клеток, площади им мунореактивного материала, концентрации и со держания в них пептида. При этом значительно (до 13%) уменьшалась доля клеток 1-го класса, а доля клеток 2-го класса, напротив, существенно возрас тала. Выявленные изменения свидетельствовали об активации синтеза пептида, что, возможно, было связано с ослаблением тормозного влияния инсу лина на NPY-синтезируюшие клетки островков [22]. Кроме того, увеличение количества идентифи цированных NPY-иммунорективных клеток могло быть связано с тем, что в процесс его синтеза до полнительно вовлекалось большое количество А- и а-клеток [21, 31], которые не подвергаются дест рукции и обладают способностью синтезировать данный пептид. Необходимо также учитывать воз можность пролиферации и дифференцировки эпи телия выводных протоков поджелудочной железы, что, по данным [25], может быть дополнительным источником cc-клеток у диабетических животных. Кроме того, в наших предыдущих исследованиях Состояние р- и NPY-иммунорсактивных (NPY-ИР) клеток островков Лангерганса у крыс в норме и при экспериментальных воздей ствиях (М ± т) Группа животных Число клеток Площадь иммунореактив ного материала в клетках, мкм2 Площадь клеток, мкм2 Концентрация иммунореак тивного материала в клетках, мкЕ Содержание иммуноре активного материала в клетках, мкЕ 13- клетки NPY- ИР- клетки р-клетки NPY-ИР- клетки р-клетки NPY-ИР- клетки Р-клетки NPY-ИР- клетки р-клетки NPY-ИР- клетки Интактные 3212 710 95,510,4 52,410,5 109,810,7 65,410,8 4,3410,02 3,9910,03 2442+15 1137115 Диабетические (3 нед) 1511“ 1612“ 112,411,4“ 69,610,7“ 131,211,4“ 80,610,8“ 3,6910,03“ 4,8910,03“ 2549+40“ 1991126“ Диабетические (5 нед) 7±0аЬ 510аЬ 132,1±1,баЬ 58,6±0,8ь 148,911,5"*’ 70,2+0,9Ь 3,5810,04“ь 3,78+0,03“ь 2894±52“ь 1198118“ь Диабетические и интраперито неальным вве дением NPY 2713Ьс 10+1“ 90,510,5abcd 50,010,7“ 107,3i0.6abtd 63.2+0,8“ 3,8810,0Г1Ь“1 3,2710,03“ 2094116abcd 920+14аЬс Диабетические с интрацеребро вентрикуляр ным NPY 2512“Ьс 8±lcd 98,710,6',Ьс“ 41,5±0,73cd 114,2+0,6““ 53,0±0,9“d 3,93+0,01““ 2,64+0,03““ 2296117“bcd 60011 lobcd Примечание, а - достоверность (р < 0,05) различий с контролем; b - с 3-недельным диабетом; с - с 5-недельным диабетом; d - между интраперитонеальным и интрацеребровентрикулярным введением показано увеличение синтеза гормонов А- и а-клетками при диабете с увеличением их количе ства в островках [3, 4]. Синтез NPY может также активироваться в сохранившихся, интенсивно функционирующих р-клетках [22] или во вновь об разованных р-клетках [33], которые регенерируют посредством дифференцировки ациноостровковых (переходных) клеток [12, 14]. В последних NPY мо жет выступать в качестве аутокринного стимулято ра созревания, что показано в работах [20, 24]. Кро ме того, определенный интерес вызывает установ ленная способность активированных макрофагов экспрессировать NPY [29]. В островках у экспери ментальных животных нами были идентифициро ваны единичные макрофаги, активация которых играет важную роль в инициации деструкции Р-клеток при диабете типа 1 [6]. К 35-му дню отмечали дальнейшее (р < 0,001) уменьшение количества р-клеток, увеличение пло щади клеток, площади иммунореактивного мате риала и содержания в них пептида, а также сниже ние концентрации инсулина в клетках по сравне нию с контролем (см. таблицу). Эти изменения указывали на прогрессирование процесса деструк ции р-клеток, что подтверждалось достоверным (р < 0,001) увеличением уровня гликемии, который составлял 18,90 ± 0,95 ммоль/л. Вместе с тем изме нение параметров р-клеток указывало на еще боль шее усиление синтеза и секреции в них инсулина. Количество NPY-иммунореактивных клеток в островках (рис. 4) и соотношение клеток 1-го и 2-го классов становилось таким же, как у кон трольных животных (см. таблицу). При этом пло щадь клеток, площадь иммунореактивного мате риала и содержание в них пептида достоверно уменьшались (р < 0,001), однако уровня контроля не достигали. Концентрация в клетках пептида снижалась по сравнению не только с 3-недельным диабетом (р < 0,001), но и с контролем (см. табли цу). Выявленные изменения, по нашему мнению, свидетельствовали о торможении синтеза пептида в островках. Последнее, возможно, было связано с деструкцией значительного количества р-клеток, часть из которых ранее синтезировала NPY [20, 22, 24, 33]. Вместе с тем увеличение процента клеток 1- го класса свидетельствовало об активации процесса секреции NPY, в котором, по-видимому, принима ли участие сохранившиеся р-клетки, а также а- и А-клетки [3, 22]. Оба способа введения NPY с 26-го по 35-й день течения диабета не только предотвращали дальней шее снижение количества р-клеток у диабетиче ских животных к концу 5-й недели, но и приводили к его достоверному увеличению по сравнению с 3-недельным диабетом (/? < 0,001). При этом отме чалась нормализация большинства параметров, ха рактеризующих состояние р-клеток (см. таблицу). В крови увеличивалась концентрация инсулина до 44,5 ± 4,9 и 47,7 ± 2,9 мг/мл при интраперитоне альном и интрацеребровентрикулярном введении пептида соответственно (у нормальных животных концентрация инсулина в крови составляла 62,1 ± 5,8 мг/мл, а у крыс с 5-недельным диабе том - 18,0 ± 3,2 мг/мл). Уровень гликемии значи тельно снижался (6,33 ± 0,62 и 6,00 ± 0,53 ммоль/л при интраперитонеальном и интрацеребровентри кулярном введении пептида соответственно). Приведенные данные показывают, что введение NPY не только уменьшало степень деструкции р-клеток, но и, по-видимому, стимулировало их регенерацию [20, 24, 33]. Кроме того, оба способа введения пептида усиливали синтез и секрецию инсулина, более выраженные при интрацеребро вентрикулярном введении, что, видимо, было обу словлено активацией центральных механизмов ре гуляции функции р-клеток [4]. Полученные нами данные позволяют предполо жить, что введение NPY оказывает влияние на от дельные звенья процесса аутоиммунной деструк ции р-клеток. Это может быть обусловлено способ ностью пептида вызывать торможение хемотаксиса макрофагов [10], которые являются основным источником ИЛ-1 [6] и TNF [5], а также уменьшать секрецию Т-хелперами 1-го типа [17] IFN-y [7, 15]. Указанные аспекты действия NPY весьма актуаль ны, поскольку ИЛ-1, TNF и IFN-y [6, 15] играют ключевую роль в деструкции р-клеток при диабете типа 1. Количество NPY-иммунореактивных клеток в островках у диабетических крыс возрастало до уровня контроля при интрацеребровентрикуляр- ном способе введения пептида, а при интрапери тонеальном - увеличивалось даже по отношению к контролю (см. таблицу). Процент клеток 1-го клас са значительно возрастал, причем в большей сте пени - при интрацеребровентрикулярном способе введения (82 и 54% соответственно). Площадь кле ток, площадь иммунореактивного материала, кон центрация и содержание в них пептида уменьша лись по сравнению со значениями этих параметров не только у диабетических (р < 0,001), но и у кон трольных животных. Описанные изменения были выражены в большей степени при интрацеребро вентрикулярном введении пептида (р < 0,001). Хроническое интрацеребровентрикулярное и интраперитонеальное введение физиологического раствора диабетическим крысам не влияло на изу чаемые нами показатели (р > 0,05). Таким образом, нами показано, что синтез NPY в островках Лангерганса у диабетических живот ных усиливается на 3-й неделе заболевания, а к концу 5-й недели возвращается к контрольному уровню. Введение синтетического пептида диабе тическим животным (в большей степени - цен тральное) предотвращало торможение синтеза пеп тида, стимулировало его секрецию и при этом в значительной степени восстанавливало количество и функцию р-клеток. По-видимому, активация NPY-ергической сис темы островков является одним из механизмов ком пенсации сахарного диабета, который включается к концу 3-й недели заболевания и истощается по мере прогрессирования патологического процесса. Экзо генное введение NPY нормализует эти нарушения и способствует торможению деструкции р-клеток [7, 10, 17], ускорению их регенерации [20, 24, 29], уве личению синтеза и секреции инсулина и восстанов лению нарушенных при развитии диабета паракрин ных взаимоотношений в островках. Что же касается установленного нами [4] и рядом других авторов тормозного паракринного эффекта NPY на секрецию инсулина у нормальных живот ных [8, 29], то, возможно, характер его влияний в ус ловиях патологии при развитии диабета может из меняться, что ранее показано нами для других изу ченных пептидов, в частности для ХЦК [1]. Следует также учитывать, что действие NPY не ограничивается его аутокринным и паракринным влиянием на [3-клетки. В частности, показано, что системное введение NPY усиливает инсулининду- цированную утилизацию глюкозы мышечной [32] тканью и, таким образом, может способствовать снижению уровня гликемии. Выводы 1. Островки Лангерганса половозрелых интакт ных крыс содержат NPY-иммунореактивные клет ки, которые характеризуются морфофункциональ ным полиморфизмом. 2. Активность NPY-ергической системы остров ков Лангерганса увеличивается к 25-му дню разви тия диабета, а к 35-му дню снижается. 3. Введение NPY животным с сахарным диабе том способствует торможению деструкции [3-кле ток, усилению синтеза и секреции инсулина, что свидетельствует об участии NPY-ергической систе мы островков в механизмах компенсации сахарно го диабета.