Участие ганглиозидов в связывании тироксина плазматическими мембранами

Необходимым условием реализации эффекта гормона является наличие рецептора в реагирующих клетках. Известно, что рецепторы гормонов щитовидной железы локализованы преимущественно внутриклеточно - в ядерном хроматине, митохондриях, цитозоле [1]. Однако тиреоидные гормоны - тироксин (Т4) и трийодтиронин (Т3), представляющие собой гидрофобные соединения, обладающие высокой мембранотропностью и способны оказывать значительное влияние на функцию мембран клеток. К настоящему времени обнаружены специфические участки связывания для Т4 и Т3 на плазматических мембранах ПМ некоторых видов клеток. Показана зависимость гормонального связывания от состава фосфолипидов и жирных кислот ПМ [5, 7].

Ключевым моментом в эффекте тиреоидных гормонов на уровне мембран, безусловно, является модификация, которой подвергаются мембранные липиды. Преимущественная локализация ганглиозидов на наружной поверхности ПМ, а также такие уникальные свойства их молекул, как большое структурное разнообразие углеводных цепей, предполагают, как нам кажется, их участие в связывании тиреоидных гормонов ПМ. Кроме того, было показано, что Т4 необходим для нормального метаболизма моносиалоганглиозидов при созревании клеток [10].

Материалы и методы

В экспериментах использовали половозрелых крыс-самлов линии Вистар массой тела 150-250 г.

Выделение высокоочищенных препаратов ПМ печени и мозга крыс проводили модифицированными нами методами

В.   Л. Воейкова [2] и К. Krislrnan и Р. Bakiram [9]] Чистоту препаратов мембран определяли по увеличению активности маркерных ферментов Nn⁺, К⁺-АТФазы, Mg²⁺-AT®n3bi, 5'- нуклеотидазы и аденилатциклазы в сравнении с гомогенатом. Подробное описание метода выделения очищенных ПМ из тканей печени и мозга и результаты определения чистоты полученных препаратов представлены в статье Я. X. Туракулова и соавт. [5].

Анализ связывания меченого гормона с препаратами мембран проводили по методу J. Ghnrbi-Chini и I. Torresrni [7]. Константы ассоциации (К_а) и максимальную связывающую емкость (MCE) рецепторов рассчитывали по кривой Скет- чарда [5].

Изучение связывания Т4 с различными фракциями ганглиозидов. в опытах in vitro проводили путем инкубации фракций, выделенных тоиквслоKнвK хроматографией (ТСХ), в среде, содержащей 10 мкл ^|4С-Т4 (0,0001 мкКи), в течение 1 ч. ' после чего их отделяли от несвязавшегося гормона. Ган-ч г.чиозиды. связанные с меткой, использовали для подсчета радиоактивности. В опытах in vivo крысам вводили ^иС-Т4 из расчета 0,05 мкКи на 100 г массы тела, животных забивали через 4 ч.

Ганглиозиды из тканей экстрагировали по методу P. Folcli и соавт. [6] с собственными модификациями. Очистку выделенных ганглиозидов производили хроматографией на сефадексе G-25 и на ДЭАЭ-целлюлозе, затем подвергали диализу и лиофилизировали. О количестве выделенных ганглиозидов судили по содержанию в них сиаловой кислоты, которое определяли перKвдат-резврцuuовым методом. Разделение гаи- гливзидов на фракции осуществляли методом ТСХ по Э. В. Дятловицкой [3|. Идентификацию выделенных фракций ганглиозидов проводили сравнением значений их Rf с этим' показателем фракций ганглиозидов мозга быка (“Serva”. Германия), а также коммерческих фракций ганглиозидов (“Sigma”. США).

Все полученные результаты обрабатывали, используя критерий Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Связывание меченого Т4 высокоочищенными препаратами ПМ клеток печени и мозга крыс было насыщаемым и специфическим [5]. Анализ в координатах Скетчарда (рис. 1) выявил по 2 сайта связывания гормона в мембранах как печени, так и мозга крыс. Первый центр связывания имел высокое сродство к Т4 и низкую емкость, а второй - низкую аффинность и более высокую емкость. Показано, что Ка высвкоаффинивго сайта в мембранах печени выше, чем в мембранах мозга (соответственно 1,8 ± 0,03 и 1,3 ± 0,02). Полученные данные коррелируют с параметрами связывания Т3 ядерными сайтами клеток анало-

ными ПМ печени (а) и мозга (б) крыс, инкубированными в стандартных условиях с меченым Т4 и возрастающими концентрациями стабильного Т4.

К, (сплошная линия) — Кл высокваффииивго сайта; К₂ (пунктирная линия) - Кд иизооаффuиивгв сайта; МСЕ] и МСЕ₂ - максимальная связывающая емкость соответствующих сайтов; а: К! = 1,8 ± 0,03*Ю⁹ М"¹, МСЕ1 = 5.0 ± 0,7 пмоль на 1 мг белка. К₂ = 0,12 ± 0 01 хЩ М”. МСЕ2 = 38.6 ± 7.3 пмоль на 1 мг белка: п: К., - 1,3 ± 0,02хщ9 _м-1, МСЕ, = 2.5 ± 0.7 пмоль на 1 мг белка, К2 = 0,2 ± 0.02хЦ)9 М 1, МСЕ2 = 28,0 ± 8.1 пмоль на 1 мг белка.

По оси ординат — отношение связанного ¹²⁵1 = Т4 с ПМ к свободному: по оси абсцисс - концентрация Т4 (в пг на 100 мкг белка ПМ).

гичных тканей. По-видимому, мембранное связывание обеспечивает транспорт, накопление и обмен тиреоидных гормонов.

Мембранные рецепторы Т₄ могут также иметь важное значение в процессе узнавания клетки гормоном. В этом плане представляло интерес изучение связывания меченого гормона с ганглиозидами ПМ.

Полученные данные, представленные в виде диаграмм на рис. 2, указывают на тканеспеци- фичность в поглощении меченого гормона. Так, ганглиозиды мембран печени связывали метку активнее, чем ганглиозиды мембран мозга крыс, за исключением дисиалоганглиозидов G_Dln и G_D3. Следует отметить, что во всех экспериментах наблюдалось максимальное связывание гормона с ганглиозидом G_M3, причем оно было наиболее значительным в опытах с ПМ печени. По- видимому, это различие связано с более высоким процентным содержанием фракции G_Ma в мембранах печени.

С целью уточнения полученных результатов были проведены эксперименты по изучению включения ^ИС-Т₄ во фракции ганглиозидов in vivo (рис. 3).

Наибольшее включение метки для печени наблюдалось во фракциях G_Dla, G_MI, G_M3. При исследовании связывания гормона с ганглиозидами мембран печени показано, что общее включение метки приблизительно на порядок выше по сравнению со связыванием в мембранах мозга. Распределение же меченого гормона по фракциям ганглиозидов также показало максимальное связывание ¹⁴С-Т₄ с ганглиозидом G_M3. Включение метки во фракции моносиалоганглиозидов, а также во фракцию G_Dla в клетках печени аналогично результатам опытов in vitro значительно превышало ее включение в ганглиозиды мембран мозга.

При сравнении полученных в опытах in vivo и in vitro данных с количественным определением состава ганглиозидов печени и мозга крыс (см. таблицу) отмечается определенная корреляция между содержанием ганглиозида и связыванием им меченого гормона.

Однако, что касается ганглиозида G_M3, процентное содержание которого относительно невелико, а связывающая способность значительно превышает таковую для других фракций, то, видимо, он играет немаловажную роль в мембранной рецепции Т₄.

Возможная роль ганглиозида G_M3 заключается либо в связывании Т₄ с последующей передачей гормона на рецептор, либо в том, что он, связываясь с Т₄, конформационно преобразует фос- фогликолипидное микроокружение рецептора, приводящее к его активации. Не исключено, что этот ганглиозид является составляющей частью рецепторного комплекса, как в случае тиреотропного гормона [4].

1. S. Hakomori [8] показал, что ганглиозиды, внедряясь церамидным остатком в белки, могут регулировать их рецепторную функцию. При этом углеводные цепочки молекул ганглиозида, как антенны, направлены к поверхности клеточной мембраны и, по-видимому, первыми вза-

^GT ^Gjje ⁵Д1и ^GM, ^gA2 ^СДЭ ^GM2 ^gM3

Рис. 2. Включение меченого Т₄ во фракции ганглиозидов НМ печени (заштрихованные столбики) и мозга (светлые столбики) in vitro.

„ - >2S_I=T4.      14_C=T₄.

Рис. 3. Связывание ¹⁴C=T₄ отдельными фракциями ганглиозидов ПМ печени (светлые столбики) и мозга (заштрихованные столбики) in vivo.

имодействуют с лигандом. Таким образом, можно с определенной долей вероятности предположить, что ганглиозид G_M3, расположенный на поверхности ПМ вблизи рецепторного белка или, возможно, будучи связанным с ним, образует “ловушку” для Т₄ и обеспечивает взаимодействие гормона с мембранным рецептором.

В ы в о д ы

1. Выявлены два сайта связывания Т₄ очищенными ПМ печени и мозга крыс, причем К_а высо-

Содержание индивидуальных ганглиозидов в печени и мозге крыс (в мкг сиаловых кислот на I г нативной ткани; п = 8)

коаффинного сайта в мембранах печени была несколько выше.

Аналнзсвясывания мсченс^т^о Т₄ синдивидв- альными ганглиозидами ПМ печени и мозга крыс показал максимальное связывание гормона с ганглиозидом G_M3 в опытах iv vivo и in vitro