Активация системы комплемента по классическому и альтернативному пути при длительном течении сахарного диабета 2-го типа

Система комплемента является важным эффекторным звеном иммунного ответа организма. У человека она состоит из более чем 20 растворимых белков и примерно такого же числа мембраносвязанных белков (рецепторов и регуляторов), находящихся как в крови, так и практически во всех остальных тканях организма и в активированном состоянии взаимодействующих друг с другом по каскадному механизму. Активация комплемента включает каскад реакций последовательного протеолитического расщепления его компонентов, многие из которых, являясь проферментами, приобретают активность только после отщепления от них соответствующих фрагментов. Активация системы комплемента приводит к генерации опсонинов, цитолитических белковых комплексов и медиаторов воспалительных реакций — инициаторов и регуляторов некроза, апоптоза и фагоцитоза, обеспечивая защиту организма как от чужеродных патогенов, так и от токсичных продуктов тканевого распада, генерируемых в самом организме. Есть 3 пути активации комплемента: классический, альтернативный и лектиновый, отличающиеся составом компонентов и пусковыми механизмами. Все 3 пути в итоге приводят к активации СЗ-конвертазы и дальнейшему формированию цитолитического мембраноатакующего комплекса (МАК), как это показано на рис. 1 [5, 9]. Нарушение функциональной активности системы комплемента наносит необратимый вред организму и вносит свой вклад в развитие многих патологических процессов [5, 9, 10,18,19].

Интерес к исследованию функциональной активности системы комплемента на поздних стадиях развития сахарного диабета 2-го типа (СД2) был обусловлен тем, что патологические повреждения сосудистой, нервной и других тканей организма, характерные для этого этапа развития заболевания [1], обусловливают развитие так называемого воспалительного иммунного ответа организма, одним из важнейших медиаторов которого является система комплемента [13].

Целью настоящей работы являлась оценка функциональной активности классического и альтернативного путей активации комплемента при СД2 на поздних стадиях развития заболевания. Для достижения данной цели в крови больных СД2 и здоровых лиц были определены общая гемолитическая активность классического пути активации комплемента, общая гемолитическая активность альтернативного пути активации комплемента и гемолитические активности С1-, С2-, СЗ- и С4- компонента комплемента.

Материалы и методы

В ходе экспериментов были исследованы образцы сывороток крови 54 больных СД2 (из них 35 женщин), находящихся на лечении в Республиканском медицинском центре "Армения" М3 РА. Средний возраст больных составлял 56,20 ± 12,34 года (М + 5), средняя продолжительность заболевания — 9,4 ±6,1 года (М ± 5). 95% обследованных имели характерные для поздних стадий диабета осложнения (микро- и макроангиопатии, нейропатии). Диагностирование пациентов проводили врачи отделения эндокринологии. В качестве контроля использовали образцы сывороток крови 39 здоровых добровольцев (из них 20 женщин). Средний возраст здоровых лиц составлял 33,96 ± 13,48 года (М + 5). Ни больные, ни здоровые лица не страдали заболеваниями аутоиммунной природы и не переносили каких-либо острых инфекционных или других серьезных заболеваний как минимум за 1 мес до начала исследований. Пациенты были информированы, что проведенные исследования будут иметь лишь научную значимость. Все они дали согласие на забор 5 мл венозной крови.

Забор крови проводили в 9:00 утра натощак пункцией из вены. Пробы сразу же помещали на лед, затем центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин и отбирали сыворотку, которую использовали в последующих экспериментах. Образцы сыворотки хранили при -30°С.

При определении общей гемолитической активности классического пути активации комплемента в качестве тест-объекта использовали бараньи эритроциты, сенсибилизированные полиспецифи- ческими кроличьими антителами ("Sigma-Aldrich Со.", США) [20]. Инкубационная смесь содержала 200 мкл сыворотки, предварительно разбавленной в 30 раз 50 мМ барбиталовым буфером (pH 7,5), содержащим 25% глюкозы, 1% желатина, 0,15 мМ СаС1₂ и 0,5 мМ MgCl₂ (Б1) и 200 мкл сенсибилизированных бараньих эритроцитов. Смесь инкубировали при 37°С в течение 60 мин при постоянном встряхивании, далее центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин, после чего измеряли оптическую плотность надосадочной жидкости при длине волны 414 нм (А₄₁₄) против отрицательного контроля (спонтанный лизис), в котором сыворотка была замещена равным объемом Б1. Это позволяет вычесть из общего количества лизированных клеток долю, обусловленную их спонтанным лизисом. Общую гемолитическую активность рассчитывали, основываясь на значении А₄₁₄ положительного контроля (100% лизис), и выражали в процентах лизированных клеток. Для получения положительного контроля 200 мкл сенсибилизированных бараньих эритроцитов инкубировали при 37°С в течение 60 мин при постоянном встряхивании и далее центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок ресус- пендировали в 400 мкл воды и, пропуская суспензию через наконечник самплера, вызывали механический лизис клеток. Бараньи эритроциты получали ранее описанным методом [14]. Конечное число эритроцитов в смеси после сенсибилизации составило 5 • 10⁸ клеток в 1 мл (А_54| = 0,35). В зависимости от полученного значения А₅₄₁ эритроцит- ную смесь либо разбавляли Б1, либо концентрировали посредством центрифугирования и последующего слива определенного количества надосадочной жидкости.

Определение общей гемолитической активности альтернативного пути активации комплемента проводили таким же образом, что и в случае классического пути, за исключением того, что в качестве тест-объекта вместо бараньих эритроцитов использовали кроличьи (1 • 10^s клеток в 1 мл), сенсибилизацию эритроцитов не проводили, Б1 содержал 5 мМ ЭГТА и не содержал СаС1₂, а концентрация в нем MgCl₂ составляла 7 мМ. Еще одно различие заключалось в том, что разбавление исследуемых сывороток перед добавлением в инкубационную смесь составляло 1:6.

Определение гемолитических активностей С1-, С2-, СЗ- и С4-компонента комплемента проводили по ранее описанному методу [14] следующим образом: к 100 мкл сыворотки, разбавленной Б2 (в 100 раз для С1, в 8 раз для С2, в 1000 раз для СЗ и в 4000 раз для С4), добавляли 100 мкл С1-, С2-, СЗ- или С4-дефицитной сыворотки, разбавленной Б2 соответственно в 20, 4, 15 и 20 раз и 200 мкл сенсибилизированных бараньих эритроцитов. В качестве положительного контроля использовали смесь, содержащую 100 мкл Б2, 100 мкл разбавленной С1-, С2-, СЗ- или С4-дефицитной сыворотки и 200 мкл сенсибилизированных бараньих эритроцитов. Далее все процедуры проводили также, как и в случае определения общей гемолитической активности классического пути активации комплемента.

Дефицитные сыворотки были получены ранее описанным методом [14]. С1-, СЗ- и ^-дефицитные сыворотки хранили при -196°С до дальнейшего использования. Получение С2-дефицитной сыворотки проводили непосредственно перед опытом.

Оптические измерения проводили с помощью прибора СЕ-292 фирмы "Cesil Instruments Ltd." (Великобритания) в кюветах длиной оптического пути 1 см.

Обработку и анализ полученных результатов проводили с использованием программного пакета "Graphpad Prizm" ("GraphPad Software", США). Для статистической обработки данных использовали /- критерий Стьюдента. Корреляционный анализ проводили по методу Пирсона.

Результаты и их обсуждение

Согласно полученным данным, у больных СД2 на поздних стадиях развития заболевания наблюдается статистически достоверное повышение как общей гемолитической активности классического пути активации комплемента (в 1,5 раза, р < 0,01; t = 2,54), так и гемолитических активностей отдельных компонентов комплемента — С1 и СЗ в 2,2 раза (соответственно / = 2,05; р< 0,046; /=3,9; р < 0,0004), а С4 в 1,8 раз (/ = 2,05; р < 0,046), тогда как общая гемолитическая активность альтернативного пути и гемолитическая активность С2- компонента комплемента остаются в пределах нормальных значений (р > 0,5). Результаты статистической обработки полученных данных представлены на рис. 2.

Следует отметить, что ни один из отмеченных параметров не зависел от пола или возраста обследованных лиц, а также от длительности заболевания у больных СД2.

Корреляционный анализ показал статистически достоверную положительную корреляцию, с одной стороны, между уровнями общей гемолитической активности комплемента и гемолитической активности его Cl-компонента (г = 0,78; р = 0,008), а с другой — между уровнями гемолитических активностей С1- и С4-компонента комплемента (г = 0,85; р = 0,01) у больных СД2.

Таким образом, результаты настоящего исследования свидетельствуют о повышении функциональной активности классического пути активации комплемента на поздних стадиях развития СД2, о чем свидетельствует повышение как общей гемолитической активности классического пути, так и гемолитических активностей С1-, СЗ- и (^-компонента комплемента по сравнению с нормой.

Следует отметить, что имеющиеся сегодня в литературе данные относительно функционального состояния классического пути активации комплемента в значительной степени противоречат друг ДРУГУ [3, 4, 11, 21].

Результаты настоящей работы находятся в соответствии с экспериментальными данными, полученными McMillan в 1980 г. [12], свидетельствующими о повышении как общей гемолитической активности классического пути активации комплемента, так и гемолитических активностей его СЗ- и С4-компонента комплемента.

Данные о функциональной активности альтернативного пути активации комплемента при СД2 впервые представлены в настоящей работе. Согласно полученным данным, этот путь активации комплемента не вовлечен в патогенез поздних осложнений СД2.

Ранее иммуногистохимическими методами было показано наличие промежуточного и конечного продуктов активации комплемента (СЗd и МАК соответственно) и на стенках эндоневральных микрососудов и микрососудов сетчатки у больных СД [8, 17], что свидетельствуете вовлечении гуморальных иммунных процессов, опосредованных активацией комплемента, в патогенез сосудистых осложнений сахарного диабета. В пользу этой гипотезы свидетельствует и тот факт, что аутоантитела к симпатическим и парасимпатическим нейронам приводят к апоптозу нейробластомных клеток путем активации комплемента [22]. Тестирование микрососудов сетчатки на наличие С-реактивного белка, маннансвязывающего лектина, Clq- и С4- компонента комплемента не выявило наличия последних, что позволило предположить возможную активацию комплемента альтернативным путем [8].

Заключение

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что альтернативный путь активации комплемента, по всей вероятности, не вносит своего вклада в процесс активации СЗ-конвертазы и последующей генерации C3d и МАК. Инициатором этого процесса при сахарном диабете скорее всего является образование антител к модифицированным белкам плазмы и сосудистой стенки с последующим образованием иммунных комплексов (которые, как известно, при этой патологии повышены [2]), что и приводит к активации комплемента по классическому пути.