Биологические эффекты тироксина в экспериментальном канцерогенезе

Тироксин (T₄) применяют в онкологической фармакотерапии уже несколько десятков лет. Создаваемая высокая концентрация Т₄ в организме позволяет снизить экспрессию этого гормона щитовидной железы при злокачественных и доброкачественных новообразованиях. Однако в последние годы проводятся исследования, результаты которых позволяют утверждать, что влияние Т₄ или препаратов на его основе на различные метаболические процессы, протекающие в органах и тканях организма, может приводить к индуцированию апоптоза и снижению пролиферативной активности клеток различной этиологии. Это касается как нетрансформированных клеток, таких как клетки молочной железы [10], (3-клетки поджелудочной железы [4], так и злокачественно пролиферирующих клеток, в частности рака молочной железы [2] и кожных лимфом [7].

Цель настоящего исследования — изучение влияния Т₄ на пролиферирующую способность и апоптоз опухолевых клеток различного патогенеза в опытах in vitro и in vivo.

Материалы и методы

При проведении исследований использовали операционный материал от 2 больных, оперированных по поводу узловых образований щитовидной железы (1) и опухоли молочной железы при гинекомастии (1).

Полученные образцы опухолей обрабатывали 0,25% раствором трипсина. Воздействие Т₄ производства "Берлин-Хеми" (Германия) проводили на одноклеточную взвесь клеток опухоли щитовидной железы in vitro, содержащую 16 • 10⁶ клеток в среде 199 на каждую дозу препарата, время инкубации 24 ч при 37°С в присутствии 5% СО₂. Контролем служил опыт без воздействия Т₄. Для количественного учета цитопатического действия Т₄ клетки окрашивали 0,1% трипановым синим и при увеличении в 80 раз подсчитывали количество окрашенных (погибших) клеток. Значение цитотоксического действия (ЦТД) определяли по формуле

ЦТД(%) = (А/В) • 100,

где А — количество погибших клеток; В — общее количество исследованных клеток.

В экспериментах in vivo использовали мышей линии С57В1 массой 20—22 г, содержащихся в пластмассовых клетках (по 6 в каждой) при стандартизированных условиях относительной влажности (50—60%), температуры (22°С) и светового режима (по 12 ч темноты и света). Мыши получали стандартный коммерческий корм и питьевую воду ab libitum.

Мышам подкожно перевивали штамм меланомы В-16. Через 48 ч после имплантации мышей распределяли на группы по 6 животных и вводили им либо разные концентрации Т₄ 10~⁴, 10~⁶ и 1СГ⁸ М/0,3 мл в физиологическом растворе, либо физиологический раствор внутрибрюшинно ежедневно в течение 10 сут.

Для определения противоопухолевой активности Т₄ на 21-й день после имплантации опухоли животных декапитировали под эфирным наркозом и выделяли образцы опухоли, которые фиксировали в 10% нейтральном формалине. Срезы толщиной 4—5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.

Апоптозные клетки идентифицировали по морфологическим признакам [3] и вычисляли апоптоз- ный индекс (АИ) по формуле

АИ(%) = (а/Ь)- 100,

где а — количество апоптозных клеток; b — общее количество исследованных клеток. Митотический индекс (МИ) определяли по формуле

МИ(%о) = (c/J)- юо,

где с — митотически делящиеся клетки; d — 1000 интерфазных клеток.

Средний объем опухоли (в см³) находили по формуле

И_ср=(я/6)-Л5С,

где — А, В, С — длина, ширина и высота опухоли. Процент торможения роста опухоли определяли в конце опыта по формуле

Т% = {(5_К - В_о)/В_к} • 100,

где В_к — средняя масса опухоли у животных контрольной группы, В_о — средняя масса опухоли у животных опытной группы.

Определение рецепторов HER2/neu проводили с помощью коммерческого набора HercepTest фирмы "Dako" (Дания). Расчет Н-баллов проводили по формуле

Н = (3 • % сильноокрашенных клеток) + (2 • % умеренно окрашенных клеток) + (1 • % слабоокрашенных клеток).

Результаты и их обсуждение

В опытах in vitro влияние Т₄ на клетки доброкачественной опухоли щитовидной железы в течение 24-часовой инкубации было дозозависимым и давало цитотоксический эффект (рис. 1). Наибольшую цитотоксическую активность Т₄ проявлял в дозе 1(Г⁸ М. Индуцирование Т₄ гибели клеток в остальных разведениях достоверно не различалось и варьировало в пределах 40—50%. Количество апоп- тозных клеток в опыте с применением Т₄ в дозе 10~⁸ М также было самым большим (9,0 ± 0,90%; р < 0,05) по сравнению с остальными концентрациями (3,2 ± 0,55%, р < 0,05; 2,5 ± 0,49%,р < 0,05; 4,5 ± 0,65%, р < 0,05; 5,0 ± 0,68%, р < 0,05 для концентраций Т₄ 10~⁷, 10~⁶, 10^-5, 10^-4 М соответственно) и контролем (1,0 ± 0,30%). Следует отметить, что тироксинподавляющая терапия при многоузловой патологии щитовидной железы дает нежелательные побочные эффекты, в основном это касается изменений в метаболизме костной ткани и сердечной мышцы [1, 6]. Снижение дозы терапевтического воздействия Т₄ может уменьшить неблагоприятные проявления тироксинподавляющей терапии с сохранением способности ингибировать пролиферацию и индуцировать апоптоз трансформированных клеток.

Одним из регуляторных белков, отвечающих за пролиферацию клеток, в частности эпителиальных, является HER2/neu (C-erbB-2). HER2/neu — онкогенный белок массой 185 кД, принадлежащий к семейству рецепторов эпидермального фактора роста EGFR [5]. Активация HER2/neu вызывает внутриклеточные сигнальные изменения, которые являются критическими для роста, дифференцировки и выживания клеток. При патологических трансформациях ткани молочной железы экспрессия HER2/neu увеличивается, а при лекарственной терапии уменьшение представительства этого рецептора на мембране клеток свидетельствует о хорошем прогнозе лечения заболевания. В случае изучения биологических эффектов Т₄ мониторинг изменения представительства HER2/neu на мембране клеток молочной железы может помочь раскрыть механизм ингибирования пролиферативной активности этой ткани. Мы исследовали количественные характеристики нахождения рецепторов HER2/neu на мембране опухолевых клеток молочной железы при воздействии Т₄ in vitro в дозах 10~⁴, 10^_6 и 10^-8 М (рис. 2). Воздействие Т₄ во всех концентрациях привело к уменьшению количества рецепторов HER2/neu на мембранах клеток молочной железы в среднем на 27,25 ± 1,14% (р < 0,001). Столь значительные изменения могут быть связаны с ингибированием Т₄ пролиферативной активности исследуемых клеток посредством сигнального управления от Т₄- опосредованных рецепторов. В свою очередь следует предположить, что подобные процессы затрагивают и генетический аппарат клетки, что приводит к изменению экспрессии определенных генов, в частности отвечающих за митотическую активность, например HER2/neu.

В опыте in vivo по определению противоопухолевой активности Т₄ в экспериментальном канцерогенезе на модели перевиваемого штамма меланомы В-16 дозозависимый эффект Т₄ по ингибированию роста опухоли не проявился (рис. 3). В среднем препарат показал 59,00 ± 5,54% (р < 0,001) торможения роста опухоли по массе и 74,12 ± 0,26% (р < 0,001) по объему; данные между опытными группами статистически достоверно не различались. Однако при исследовании пролиферативной и апоптотической активности клеток меланомы В-16 отмечено, что наибольшее ингибирование митозов и индуцирование апоптоза происходит при применении Т₄ в дозе 10^-8 М (см. таблицу), при этом значения МИ и АИ у этой группы экспериментальных животных отличались от других опытных групп и контроля более чем в 3 раза, а индекс отношения апоптозной активности к митотической (АИ, МИ) составил 8,19, что свидетельствует о высокой скорости регрессии опухоли. Введение Т₄ в других концентрациях (10^-4 и 10^-6 М) не вызывало статистически достоверных отличий МИ по сравнению с контролем, хотя количество апоп- тозных клеток у животных этих опытных групп достоверно выше контроля, и это, а также высокая противоопухолевая активность Т₄ в этих дозах позволяют утверждать, что получаемые значения АИ/ МИ > 1 (1,35 для дозы 10~⁴ М и 1,19 для дозы 10^_6 М) достаточно объективны и свидетельствуют о протекании процесса регрессии опухоли.

Т₄ ингибирует пролиферацию и индуцирует апоптоз клеток, имеющих на мембране рецепторы к Т₄ и способных изменять течение метаболических процессов под его воздействием. Спектр Т₄- мишеней довольно широк и в сферу его влияния входят не только клетки гормонпродуцирующих органов, например молочной железы, но и другие типы клеток, в частности меланинсодержагцие. Т₄-эффекты приводят к перестройке в презентации регуляторных белков на поверхности мембраны клеток, изменению секреции гормонов и коррекции Са²⁺-гомеостаза, что в итоге и может активизировать процесс апоптотической гибели клеток [8, 9].

Выводы

1. Наибольшую цитотоксическую активность in vitro в отношении клеток доброкачественной опухоли щитовидной железы Т₄ проявил в дозе 10^-8 М (70 ± 4,58%; р < 0,05). В этой же дозе Т₄ индуцировал наибольшую апоптозную гибель клеток (9,0 ± 0,90%; р < 0,05) по сравнению с контролем (1,0 ± 0,30%).
2. Воздействие Т₄ in vitro в дозах 10'⁴, 10“⁶ и 10^-8 М на клетки молочной железы с гинекомастией привело к уменьшению количества онкогенного белка HER2/neu в среднем на 27,25 ± 1,4% (р < 0,001).
3. В экспериментальном канцерогенезе на моде ли опухолевого штамма меланомы В-16 Т₄ в концентрациях 10~⁴, 10~⁶ и 1СГ⁸ М проявил in vivo высокую противоопухолевую активность (59,00 ± 5,54%, р < 0,001 торможения роста опухоли по массе и 74,12 ± 0,26%, р < 0,001 по объему). Наибольшую антипролиферативную активность Т₄ показал в дозе 10~⁸ М (МИ 1,3 ± 0,16%о, р < 0,001; АИ 10,65 ± 1,39%, р < 0,001) по сравнению с контрольной группой (МИ 4,96 ± 0,43%_о; АИ 4,43 ± 0,40%).