Влияние препарата рекомбинантного гормона роста человека биосомы на процесс заживления глубокого ожога кожи крыс

Многогранное влияние гормона роста (ГР) на организм привлекает к себе внимание специалистов разных областей медицины. На протяжении последних десятилетий диапазон клинического применения ГР распространился за пределы области интересов лишь эндокринологов. Мощные анаболические свойства гормона роста нашли применение при коррекции послеоперационных гиперкатаболических состояний и сердечной недостаточности. Эксперименты показали эффективность ГР при лечении плохо заживающих ран различной этиологии, переломов костей, тяжелых ожогов [3, ". 17, 19, 24, 25]. Производство рекомбинантного ГР (рГР) человека и распространение препарата на рынке лекарств послужило мощным толчком для исследования возможности его применения в различных областях медицины. Первые попытки применения рекомбинантного аналога ГР человека произведены в 1982 г. при лечении гипофизарного нанизма [12]. В 1990 г. D. Herndon и соавт. опубликовали результаты исследований по применению рГР человека при лечении тяжелых ожогов у детей [10, 11]. С этой целью использовали 2 несколько различающихся препарата рГР человека — нутропин и протропин ("Genentech Inc.", США). Протропин — рекомбинантный полипептидный гормон из 192 аминокислот с добавочной метиониловой кислотой и мол. массой 22 000 Д. Нутропин

• рекомбинантный ГР с аутентичной последовательностью 191 аминокислоты. Оба препарата показали одинаково хороший результат: более быстрое восстановление структуры кожи, эпителиза- цию донорских ран, сокращение времени пребывания в стационаре на 25—30%.

Предприятие Литвы ЗАО "Biotechna" производит аналог ГР — биосому. Это полипептид из 190 аминокислот мол. массой 21 500 Д, аналогичный по своей аминокислотной последовательности гипофизарному ГР человека, за исключением недостающей на N-конце фенилаланиновой кислоты. Препарат зарегистрирован в фармакопейном регистре Литвы в 2000 г. под № 387. Цель нашей работы

• определение влияния биосомы на скорость заживления полнослойного ожога кожи крыс IIIB степени путем планиметрии ожоговой раны.

Материалы и методы

Согласно протоколу эксперимента, утвержденному независимой комиссией Каунасского медицинского университета по этике и Республиканской государственной пищевой и ветеринарной службой, экспериментальных животных (самок крыс линии Wistar, альбиносов) помещали в виварий и обеспечивали сухим гранулированным комбикормом, обогащенным витаминами и минералами, при неограниченном доступе к воде. Семь дней ' до начала эксперимента служили для акклиматизации животных в виварии, оценки у них фазы роста волосяного покрова и дальнейшего отбора грызунов с анагенной фазой роста. Все процедуры проводили под общим обезболиванием, для которого использовали внутримышечное введение кетамина (Calypsol, "Gedeon Richter А. О.", Венгрия) 100 мг/кг и диазепекса (Grindex) 10 мг/кг для премедикации. Используя метод случайных чисел, животных разделили на 2 группы под условными названиями "ожоговая рана контрольная" — ОРК (л = 27) и "ожоговая рана гормональная" — ОРГ (л = 27). Грызунам после удаления волосяного покрова в паравертебральной области спины на уровне пояса нижних конечностей наносили контактный ожог коммерческим паяльником мощностью 100 Вт при напряжении тока сети 220 В и частоте 50 Гц. Ожог вызывали прижатием паяльника его собственной массой 160 г (1,56 н). Дополнительного давления рукой на паяльник не производили. При температуре помещения около 20°С наконечник паяльника площадью 2,2 х 2,2 см² нагревался до 240°С. Экспозицию прижатия паяльника разделили на 2 периода — 10 и 4 с, между которыми проводили охлаждение ожоговой раны кусочками льда во избежание общего перегрева животного. Затем рану смазывали 1% кремом сульфадиазина серебра "Dermazin" производства KRKA. Неприлипающую повязку "Kolmi" (Финляндия) фиксировали к коже отдельными атравматическими швами. День нанесения ран животным считали 0-м. Ожоговые раны перевязывали на 4-й и 8-й день после нанесения ожога. Во время перевязки рану фотографировали, помещая в поле зрения метку стандартной величины 2 х 2 см². Во время 2-й перевязки производили некрэктомию, механически удаляя нежизнеспособные ткани. Затем перевязки проводили каждый 2-й день. Во время перевязок проводили туалет ран, промывая их 0,05% раствором хлоргексидина. Процесс заживления ран оценивали по уменьшению их площади. Для этого фотографическое изображение ран преобразовывали в числовое с дальнейшей обработкой его компьютерной программой "Image Tool" (The University of Texas Health Science Center in San Antonio). Начальную глубину ожогового поражения определяли путем морфологического исследования препарата раны в 0-й день, производя эксцизию ожога с фиксацией препарата нейтральным формалином. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином и трихромом, затем исследовали с помощью оптического микроскопа. После биопсии крыс усыпляли. Животным из группы ОРГ ежедневно проводили инъекции биосомы под кожу в дозе 2,0 мг/кг в течение всего периода эксперимента.

Данные, полученные в ходе эксперимента, приводятся как среднеарифметические значения серии измерений (± стандартная ошибка). При статистической обработке использовали дисперсионный и корреляционный анализ. Значение вероятностной ошибки р — 0,05 считали достаточным.

Результаты и их обсуждение

При оценке заживления раны по изменению ее площади как проявления интегральной характеристики процесса заживления возникла необходимость воспроизведения модели ожоговой раны животных с четко ограниченными краями, равной по площади и глубине ожога. Распространенный метод экспериментального ожога путем ошпаривания кипятком [23] для этих целей неприемлем. Большинство моделей ожога путем ошпаривания кожи не создает четкой демаркационной зоны и поэтому не соответствует нашей задаче [2, 15]. Мы выбрали экспериментальную модель контактного ожога, при котором легче достигнуть ран одинаковой площади и глубины. В литературе описаны разные температурные режимы, используемые для получения глубокого ожога. Тепловую энергию q, передаваемую кондукцией от металлической поверхности к коже, рассчитывают по формуле

где К — коэффициент теплопроводимости; L — расстояние проникновения тепла; Т_} — температура металлической поверхности; 7^ — температура тканей [5]. Глубина ожога зависит в основном от переданной тканям энергии и прямо пропорциональна времени передачи [9]. Описано явление, когда сформировавшийся струп препятствует дальнейшему проникновению тепла в глубину тканей [2]. Поэтому мы изменили экспозицию, применяемую другими авторами при получении глубокого ожога (170’С, 20 с). Для уменьшения кондукции тепла за пределы пластинки увеличили температуру до 240°С, но при этом сократили время до 14 с. Гистологические исследования препаратов показали эффективность нашей методики получения воспроизводимого полнослойного ожога с четко выраженными границами поражения кожи.

При планировании эксперимента не ставили цель достичь полного заживления ран, так как маленькая рана, покрывшись струпом, визуально не меняется и не подлежит планиметрической оценке. Во время опыта рана 1 животного из группы ОРК нагноилась, и крыса была исключена из эксперимента. В группе ОРГ из-за повышенной чувствительности к анестетикам погибла 1 крыса.

При прикосновении нагретой металлической пластины мы наблюдали втягивание шкуры крыс под пластину. Это втягивание можно объяснить сокращением коллагеновых волокон кожи, дегидратацией ткани, сокращением мышцы panniculus саг- nosum кожи крысы. Похожее явление описывают и другие авторы [18]. Обожженная кожа приобретала коричневато-перламутровый оттенок, теряла подвижность и эластичность. Глубину ожога определяли с помощью морфологической оценки тканей (рис. 1). На всех препаратах глубина некроза охватывает мышечный слой кожи крыс panniculus саг- nosus.

На 8-й день эксперимента удаляли нежизнеспособные ткани механическим способом. После удаления некроза наблюдали увеличение площади раны до величины, превышающей начальную (рис. 2).

Как начальный размер раны, так и ее размер после некрэктомии у крыс обеих групп статистически достоверно не различался. Статистически достоверное различие в размере раны возникает уже на 2-е сутки после некрэктомии (10-е сутки эксперимента). Раны у крыс группы ОРГ уменьшились до начальной величины на 10-й день заживления, в то время как раны крыс группы ОРК — только на 15-й. На 22-й день эксперимента раны у крыс группы ОРГ уменьшились в среднем до 0,29 ± 0,04 см², покрылись струпом и были оценены как зажившие, в то же время средняя площадь раны у крыс из группы ОРК в этот день составила 1,41 ± 0,16 см². Регрессионный анализ показал возможность полного заживления ран в группе ОРГ на 24-е сутки, а в группе ОРК — приблизительно — на 33-и. Сравнение линейных регрессий выявило разницу продолжительности заживления ран 27% (9 дней). На рис. 3 показано изменение площади раны по отношению к начальной ее величине.

ГР непосредственно и через своего посредника — инсулиноподобный фактор роста I (IFG-I) оказывает влияние на заживление начиная с самых ранних стадий до процесса эпителизации [16]. Влияние ГР на заживление ран разной этиологии как в клинике, так и в условиях эксперимента описывают разные авторы [8, 10, 13, 14, 21, 22]. Они отмечают воздействие ГР на формирование грануляционной ткани, депозицию коллагена, синтез базальной мембраны эпидермиса кожи, миграцию и пролиферацию эпидермоцитов. R. Hintz и соавт., Р. Jergensen и соавт. доказали стимулирующее воздействие ГР на формирование грануляционной ткани и биомеханические свойства зажившей резаной раны кожи крыс в эксперименте [12, 13]. D. Herndon и соавт. убедительно показали ускорение эпителизации донорских ран ожоговых больных под воздействием ГР [10, 11]. Основываясь на результатах этих работ, мы выдвинули гипотезу о том, что ГР, ускоряя процессы заживления на разных этапах, должен сократить период восстановления ткани от момента нанесения поражения до эпителизации раневой поверхности. Воздействие ГР не ограничивается непосредственной активацией фибробластов и увеличением продукции коллагена матрицы раны, ускорением синтеза базальной мембраны и миграцией эпидермоцитов. На течение раневого процесса благоприятно воздействует влияние ГР на катаболизм организма в целом. Поэтому мы выбрали метод планиметрии изменения площади раны как показатель интеграции всех процессов на разных этапах заживления. Метод планиметрии раны, довольно распространенный среди исследователей, изучающих влияние препаратов на скорость заживления ран [5], при изучении воздействия ГР до сих пор не применяли.

Задачи, стоящие перед исследователями, определяют выбор методов и способов получения ожидаемых результатов. От особенностей выбранной модели эксперимента во многом зависит и достоверность полученных результатов. Поэтому при выборе вида экспериментальных животных для исследования мы руководствовались критериями наиболее полного соответствия биологических процессов восстановления тканей у экспериментального животного и заживления ран человека; влияния видовой специфичности ГР и зависящей от этого биологической активности биосомы у выбранного типа животных.

Несмотря на то что механизм заживления полнослойных дефектов кожи у разных млекопитающих имеет одинаковую последовательность гуморальных, клеточных, внеклеточных механизмов и этапов восстановления тканей (воспаление, формирование грануляций, эпителизация и ремоделирование рубцовой ткани), аутентичного соответствия процессу восстановления тканей человека нет ни у одного вида млекопитающих. Даже у стоящих рядом с человеком на лестнице эволюции приматов при заживлении раневого дефекта кожи отсутствует феномен гиперпродукции коллагена в области рубца. Знание специфичности процессов заживления тканей у выбранного вида животных помогает избежать ошибок при обобщении результатов эксперимента. Несомненно, при выборе экспериментальных животных далеко не последнюю роль играют финансовые возможности экспериментаторов, уход и условия содержания, соответствующие международным стандартам обращения с лабораторными животными. Отчасти поэтому при изучении процессов восстановления соединительных тканей человека наибольшее распространение получили грызуны как объект моделирования раневого процесса. Хотя у грызунов (крыс, морских свинок, кроликов) имеется анатомическое отличие в строении кожи — мышечный слой panniculus саг- nosus, являющийся главным источником клеток, производящих коллаген, это не помешало им стать наиболее часто используемым объектом для моделирования раневого процесса человека. Еще одно отличие, оказывающее влияние на процесс заживления ран крысы и человека при неполноценной диете или других состояниях, вызывающих гиповитаминоз С, — это обязательная коррекция гиповитаминоза у человека и отсутствие необходимости обеспечения экзогенной аскорбиновой кислотой крыс, так как у них она синтезируется в кишечном тракте. Аскорбиновая кислота, как известно, является важным кофактором при синтезе коллагена. Исходя из этого, морские свинки более соответствуют требованиям эксперимента, но они, к сожалению, менее устойчивы к инфекции. Приматов, несмотря на близость к человеку, экспериментаторы тоже редко выбирают из-за вышеуказанных причин [4]. J. Moserova, Е. Houpkova [18] в своей монографии указывают, что морфологически коже человека наиболее соответствует кожа свиньи. Однако выбор экспериментальной модели нередко ограничен финансовыми возможностями исследователя. Несмотря на перечисленные различия, заживление ран животных служит основной моделью при воспроизведении раневого процесса человека. Как утверждают I. Cohen, В. Mast, видовое различие раневого процесса у млекопитающих почти не влияет на результаты исследований [4].

Видовая специфичность ГР, по данным литературы, имеет немаловажное значение для биологической активности препарата. К концу 1960 г. антигенность ГР по отношению к другим видам животных стала очевидной [1]. Крысы долгое время реагируют на ежедневные инъекции ГР всех млекопитающих, за исключением приматов, действие которых продолжается лишь около 10 дней. Филогенетически низшие виды животных реагируют на ГР высших видов, но обратного действия не наблюдается. Для моделирования процесса заживления ожоговой раны выбор в качестве экспериментальных животных крыс мы считаем обоснованным и правомерным. Не экстраполируя абсолютные значения полученных результатов на сроки заживления ожога у человека, мы оптимистично оцениваем возможность применения биосомы в клинике при лечении тяжелообожженных детей.

Выводы

1. Выбранная нами модель ожога — нагретая до 240°С медная контактная пластина размером 2,2 х 2,2 см и прижатая с силой 1,56 н в течение 14 (10 ± 4) с — вызывает глубокий ожог кожи крыс.
2. Инъекции рекомбинантного ГР человека биосомы в дозе 2,0 мг/кг в сутки сокращают время заживления глубокого ожога кожи крыс на 27%.